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蛋白質(zhì)的濃縮方法

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蛋白濃縮方法基本有:

1. 透析袋濃縮法
利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋(無(wú)透析袋可用玻璃紙代替),結扎,把高分子 (6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蠟)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30%-40%濃度的溶液,將裝有蛋白液的透析袋放入即 可。吸水劑用過(guò)后,可放入溫箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。
主要用于更換蛋白質(zhì)的緩沖液,有透析袋即可,不需要特殊的儀器。

2. 冷凍干燥濃縮法
這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法,它既使蛋白質(zhì)不易變性,又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下 冰凍,然后移置干燥器內(干燥器內裝有干燥劑,如NaOH、CaCl2和硅膠等)。密閉,迅速抽空,并維持在抽空狀態(tài)。數小時(shí)后即可獲得含有蛋白的干燥粉 末。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便,應用時(shí)可配成任意濃度使用。也可采用凍干機進(jìn)行冷凍干燥。
在冷凍狀態(tài)下讓揚品種的液體升華

3. 吹干濃縮法
將蛋白溶液裝入透析袋內,放在電風(fēng)扇下吹。此法簡(jiǎn)單,但速度慢,且溫度不能過(guò)高,最好不要超過(guò)15℃。

4. 超濾膜濃縮法
此法是利用微孔纖維素膜通過(guò)高壓將水分濾出,而蛋白質(zhì)存留于膜上達到濃縮目的。有兩種方法進(jìn)行濃縮:一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過(guò)濾器內,在不斷攪拌之下過(guò)濾;另一種是將蛋白液裝入透析袋內置于真空干燥器的通風(fēng)口上,負壓抽氣,而使袋內液體滲出。
主要針對小體積蛋白質(zhì)溶液(幾ml)此法更不易引起變性,不過(guò)得有濃縮器,不是哪個(gè)實(shí)驗室都有的。

5. 凝膠濃縮法
選用孔徑較小的凝膠,如SephadexG25或G50,將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數而稱(chēng)取所需的干膠量。放入冰箱內,凝膠粒子吸水后,通過(guò)離心除去。

6. 濃縮膠濃縮法
濃縮膠是一種高分子網(wǎng)狀結構的有機聚合物,具有很強的吸水性能。每克干膠可吸水120ml~150ml。它能吸收低分子量的物質(zhì),如水、葡萄糖、蔗糖、 無(wú)機鹽等,適宜濃縮10 000分子量以上的生物大分子物質(zhì)。濃縮后,蛋白質(zhì)的回收率可達80%~90%。比凝膠應用方便,直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意,濃縮溶液的pH 值應大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn),否則在濃縮膠表面產(chǎn)生陽(yáng)離子交換,影響濃縮物質(zhì)的回收率。

7. 丙酮沉淀法:
試驗要求的儀器簡(jiǎn)單,但是常常導致蛋白質(zhì)變性。

8. 免疫沉淀法:
通過(guò)免疫沉淀法,用蛋白質(zhì)特異性能夠定量能夠分離目的蛋白。有三個(gè)步驟組成:首先將特異性抗體加入細胞提取物,第二步加入經(jīng)化學(xué)固定的金黃色葡萄球菌, 以確保形成大量沉淀。這些細菌通過(guò)蛋白質(zhì)A和抗體形成復合物,蛋白質(zhì)A與免疫球蛋白的Fc部分有高度的親和性?;蛘哒f(shuō),純化的蛋白A結合 Sephrarose樹(shù)脂,為從細胞提取物中分離出抗原抗體復合物,提供一個(gè)固體基質(zhì)。最后通過(guò)洗脫,除去尚未沉淀的雜質(zhì)。
為了除去已破碎的或固定差的細胞,在用于免疫沉淀(作用)之前可以與纖細地金黃色葡萄球菌細胞,如果要用蛋白質(zhì)ASephrarose樹(shù)脂,參考廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)。

9. 硫酸銨沉淀法:
利用高濃度鹽將蛋白質(zhì)析出(鹽析),選擇硫酸按是因為:鹽析有效性,pH范圍廣,溶解度高,溶液散熱少,經(jīng)濟.

10. (低溫)有機溶劑沉淀法:
強調低溫(0-4度以下)是因為10度時(shí)蛋白會(huì )在有機溶劑中變性,可用乙醇,丙酮等。注意:Mg2+離子,pH值。

11. 聚乙二醇(PEG)沉淀法:
PEG是一個(gè)水溶性非離子多聚體,使用PEG時(shí)旨在個(gè)別情況下才會(huì )是蛋白質(zhì)稍有變性!他溶解是散熱低,形成沉淀的平衡時(shí)間短,通常達到30%時(shí)蛋白質(zhì)就會(huì )達到最大量的沉淀。

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